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    公开号:WO1987003602A1
    申请号:PCT/JP1986/000613
    申请日:1986-12-02
    公开日:1987-06-18
    发明作者:Yasuhiko Masuho；Toru Sugano；Yoh-Ichi Matsumoto；Shigeki Fujinaga
    申请人:Teijin Limited；
    IPC主号:C07K16-00
    专利说明:
    [0001] 明
    [0002] 発明の名称
    [0003] サイ 卜メガロウィルスに対するヒ 卜 ♦ モノクロ一ナ ル抗体とその製造法
    [0004] 技術分野
    [0005] 本発明は、 サイ 卜メガロウィルス（Cytomegaio-virus, 以 F CM Vと略記する） に対するヒ 卜モノクローナル抗 体（monoclonal antibody, 以下 M CAと略記する〉 とそ の製造法に関する。 その目的とするところは、 GMV感 染症の診断， 予防及び治療に役立つところの、 ClMVに '特異的なヒ 卜 M CAを提供することにある。
    [0006] ½景技術
    [0007] C iVI Vはヘルべス ♦ ウィルス属に属するウィルスの一 つであり、 D A, コアタンパク， 力プシッ ドとェンビ ロープから成っている。 このウィルスが人間に感染して も、 多くの場合何の疾病も引き起こさない。 しかしなが ら、 免疫能力の低下した新生児では肝炎を起こしたり、 臟器移植のために免疫抑制された患者に間質性肺炎を起 こし、 しばしば致命的な感染症を引き起こす。 従って、 この感染症の診断， 予防及び治療は大きな医療ニーズが ある。 Cond I eB (Ameri can J. Hed i c i ne, March 30, 134- 141, 198 参照〉 は骨髄移植患者に杭 CM V抗体価の高 ぃヒ 卜血清グロプリンを投与し、 CM V感染とそれによ る間質性肺炎を防ぐことに成功している。 高力価のヒ 卜 血清グロプリンは、 血清提供者の抗体価をあらかじめチ ェ 、 クし、 高力 iffiである血槳のみを収集して分画される。 この方法で得られる血清グロプリンの、 CM Vに対する 抗体価はランダムに収集されたものの高々 10倍にしか過 ぎず、 かっこのように高力価血清グロブリンを収集する ことは非常に困難であり、 安定に供給することができな い。
    [0008] Mi I steinと (fillerによつて確立されたハイプリ ドーマ 法によって、 高純度の抗体、 すなわち M CAが作製でき るようになった。 asmussen ら (Proc. Watに Acad. Scに USA, 81,876-880, 1984 参照〉 は C M Vをマウスに免疫 し、 そのマウス脾細胞とマウス ♦ ミエローマ細胞を融合 することによって、 V特異的 iVI C Aを産生するハイ ァリ ドーマを作製した。 彼女ら以外にもいくつかの研究 グループが C M Vに対するマウスの IV1 C Aを得ている (例えば、 Goldstein ら， Infection and Immunity, 38 .273-281, 1982; Pe「eiraら， Infection and Immunity, 36; 924-932,. 1982 参照） 。 これらの M GAの中にあつ て、 ウィルスを中和する活性を有する M CAは少ないが、 Rasmussen らの M CAは、 約 10〃g で CM Vを中和 する能力がある。 これは高力価血清グロプリンと比較し たとき、 極めて高い中和活性であり、 このような M CA による C M V感染症の予防あるいは治療が期待される。 しかしながら、 これらはマウス由来の M C Aであり、 人 体に投与したとき異物として認識され不都合な副作用を 引き起す。 そこで、 マウス由来でなく、 ヒ 卜由来の抗 C iVI V ♦ M C Aが望まれる c
    [0009] 一般にヒ 卜由来の M C Aはマウス ♦ ミエ口一マ細胞， ヒ 卜 ♦ ミエ LJ一マ細胞あるいは他のリンパ系樹立細胞と ヒ 卜 ♦ リンパ球とを細胞融合して得られるハイプリ ド一 マから産生される。 あるいはヒ 卜 ♦ リンパ球を E Bウイ ルスによって変異させたリンパ芽球細胞からも産生され る： 1980年から現在まで、 多くのヒ 卜 M C A作製の試み • -がなされてきた.が、 いずれの方法もそれぞれ固有の問題- をかかえているつ マウス ♦ ミエロー とヒ 卜 ♦ リ ンパ球 との細胞融合で得られたハイアリ ドーマの M C A産生は 不安定であるし、 ヒ 卜 ♦ ミエ口一マ細胞とヒ 卜 ♦ リンパ 球との細胞融合は極めて効率が悪い。 また E Bウィルス によつ τ得られるリンパ芽球細胞の M C Α産生は量が少 なく、 かつ不安定である- その上、 Ez Bウィルスは腫瘍 を引き起こす能力を有し 〔おり、 安全性上大きな問題が ある。 このように j C A産生細胞を樹立する技術におい て大きな障害があるが、 さらにもう Ί つ、 特定抗原に特 異的なヒ 卜 Aを得るためには大きな障害がある。 そ れは十分に免疫されたヒ 卜 ♦ リンパ球を得るという課題 である。 一般に £常人のリンパ球は C M Vによって感作 されていることが多いが、 その免疫度合いは極めて低い c 従って、 正常人のリンパ球からハイプリ ドーマあるいは リンパ芽球細胞を樹立しても、 抗 CMV * MCAを産生 する細胞を得られる見込みはほとんどない。
    [0010] CM Vに対するヒ 卜 MG Aについては Ίつだけ産生細 胞株が得られたとの報告がある （ J. Immunol. ; 133,
    [0011] 2^02-2205, 198 参照〉 。 これによると、 正常人リンパ 球を E Bウィルスで変異させて、 MC A產生細胞株が得 られている- しかしながら、 記載されている内容は一葉 の螢光抗体写真のみであり、 ！VICAを安定に産生してい る細胞株が樹立できたのか否か明白ではない。 さらに前 述したように、 E B'ウィルス由来の発癌性も問題があり、 人体に投与することは大きな危険を伴う。 また、 この方 法によつて得られた M C Aは、 C iVI Vに結合するとして も C M Vを中和する能力を全く有していないことが明ら かにされている。
    [0012] 以上の如く、 目的とする特異性を有するヒ 卜 iVIC Aを 効率よく収得する上で最も大きな問題は、 ヒ 卜 ♦ リ ンパ 球を特定の抗原で十分免疫することが困難であるという ことである- マウスの場合には、 生体にとって有害な抗 原であっても投与し得るし、 さらに都合のよい投与スケ ジュールで免疫することができるが、 人間の場合にはこ れができない。 CMVは病原体であり、 ワクチンが出来 ていない現在、 人間に CM Vを故意に投与し、 免疫する ことは倫理上許されない。 ヒ 卜 MCAを作製する上で、 次に問題となる点は、 ヒ 卜 M C Aを安定に産生する細胞 を樹立する方法である。 ハイプリ ドーマ法も E B V法も 一長一短があることは前にも述べた通りである。
    [0013] 発明の開示
    [0014] 本発明者らは、 抗 C!M V * ヒ 卜 M CAを取得すること を目的として鋭意研究を行った結果、 in V ro でマイ 卜—ジェン存在下に、 C V又は C M V由来の蛋白若し くは糖蛋白で感作したヒ 卜 ♦ リンパ球と、 マウス ♦ ミエ ローマ細胞とを融合させる方法によって、 抗 CM V ♦ ヒ 卜 |V1 C Aを産生するハイァリ ドーマを得ることができた , ： そして、 このハイ 7·リ ドーマ及ひ / 乂-はそれに由来する 細胞株を培養し、 培養上清から抗 C VI V ヒ 卜 IV1 CAを 採取することができた。
    [0015] 本発明のヒ 卜 iVl C Aは、 C M V及び/又は C M V感染 細胞に反応する抗体である。 本発明の抗 CM V ♦ ヒ 卜 M 〇 の で好ましいのは Ϊ gG1型のものであり、 これはま た 2つの種顇に分けられる。 一方の種類の M C Aは、 分 子鼂約 64, 000の CM V抗原蛋白 . または分子量約 64, 000 の抗原蛋白を主成分と _する複数の C;Vl V抗原蛋白を認識 する。 他 の種類の iVl (〕 は、 分子譽約 130.000 と約 55,000の CM V抗原蛋白を認識する。 そして、 後者は、 C M Vを中和する能力を有し、 ァメ リ カン タイプ 力 ルチヤ― コ レクショ ン （ A T C C に寄託番号 HB9215 として寄記されているハイアり ドーマじ 41 、 又はそれと 同様な抗原蛋白を認識するハイプリ ドーマによって産生 される。
    [0016] 図面の簡単な説明 - .
    [0017] 第 Ί図は、 本発明の抗 CM V ♦ ヒ 卜 M CAの、 CM V に対する中和活性を示す図である。 第 2図は、 本発明の 抗 CM V.♦ ヒ 卜 IM G Aの免疫沈降分析の結果を示す図で める。
    [0018] 発明を実施するための最良の形態
    [0019] 本発明において用いられるヒ 卜 ♦ リンパ球は脾臓， リ ンパ節， 末梢血， 骨髄， 扁桃， アデノイ ド等の中に含ま れている。 本発明の目的のためには、 いかなるソースの リンパ球でも用いることができるが、. 望ましくは脾臓， 骨髄又は扁桃である。
    [0020] マウスのミエローマ細胞としては、 8—ァザグァニン 耐性株を用いるのが有利であり、 公知のものとしては、
    [0021] BALB/Cマウスの P3x 65Ag8株， P3-WS1/1- 株， P3x 63/gU1株, SP2./0Ag14 株， P3x 63Ag8.6.5.3 株， MPC11- 45.6.1G1.7株， SP- 1株等がある。
    [0022] 本発明においては、 ヒ 卜のリンパ球とマウスのミエ口 —マ細胞とを融合させるに先立って、 ヒ 卜のリンパ球を in V roでマイ 卜 —ジ 1ン存在 に抗原感作する。 ヒ 卜 の場合、 正常人では CM Vに対する抗体を産生し得る能 力のあるリンパ球は存在しても、 その数が極めて少ない そのため目的とするハイプリ ドーマが得ら.れる可能性が 極端に低い。 これに対して本発明の i n v roでヒ 卜 ♦ リ ンパ球を感作する方法を採ったときには、 その抗原に特 異的な抗体を産生するリンパ球が選択的に分化、 増殖し、 その結果、 効率よく目的の M C Α産生ハイプリ ドーマを 得ることができる。
    [0023] 本発明の実施例においては、 感作抗原として C Vの A D 169 株が用いられているが、 他の実験用 CM V株あ るいは臨床分離 C iVl V株でも感作できる。 さらに〇 M V そのもの なく、 その構成蛋白若しくは構成糖蛋白を闬 いてちよい。
    [0024] 7ィ 卜一ジ 1ンとじては、 -リンパ垛の分化及び増殖を 促進させるものならば何でもよいが、 例えば、 ポークウ イー ドマイ 卜ジ1ン （ PWM ) , B細胞増殖因子（B eel I growth factors, Bじ GF) , ァロ亍イ ン A , フ ィ 卜へ ム - グルチニン （ P H A ) ， コン力ナバリ ン Aがある σ 好ましいのは 2 〜 '200 Q / /^の PWMあるいは 100 分の Ί 容から 3分の Ί 容の BCGFである。
    [0025] 感作の 法条件は特に限定されるものではないが、 抗 ( 0 V , 又は〇 iVl V由来の蛋白若しくは糖蛋白） の 濃度は 'し " g , i 〜 Ί ng ,' ηέ f Ρ W： Iは 2〜 200 , ϊά, Β C (3 Fは 100 分の 1 容から 3分の Ί 容， リ ンパ球 (抗体産生細胞） の濃度は Ί、Χ 105 〜 1 x 107 個./ /^が 適当であり、 培養温度は 35〜4(TCで培養時間は 4〜10日、 好ましくは 6〜8曰である。 培養液は人， 牛， 馬等の血 清を含むものなら何でもよいが、 特に胎児牛血清 （ F C S ) を含む培養液 （例えば R PM I 1640) が好ましい。
    [0026] かく して得られた CiM Vで感作したヒ 卜の抗体產生細 ' 胞とマウスのミ丄ローマ細胞とは、 次いで公知の方法に ' 従って細胞融合せしめられる。 例えば、 リンパ球とミエ ローマ細胞を 10： Ί 〜 Ί : 100 、 好ましくは 1 ： Ί 〜 Ί 10の比率で混合し、 適当な細胞融合溶液、 例えば約 35% ポリエチレングリコール （分子量 1,000 〜6,000 程度〉 および約 7.5 %ジメチルスルホキシドを含む R P M I 1640を加えて、 室温〜 37°Cで Ί 〜数分間攪拌し、 その後 10% F CS加 R P [ 1640で徐々に希釈し、 洗浄の後、' H A T ( ヒポキサンザ ン一アミノプ亍リ ン一チミジン） 選択培養液にて細胞濃度が Ί 〜 5 X 105 個 /^となるよ うに調整する。 これを 0.2 ^ずつ、 例えば％穴プレー 卜 に分注し、 5 % 002を含む空気中で35〜38。0で 3〜 4週 間培養する。 H A T培養液中ではハイプリ ドーマのみが 生存し、 8— ァザグァニン耐性のミ 丄ローマ細胞及びミ 1口 マ同十の融合細胞は生存し得ない （未融合の抗体 產生細胞は数曰で死滅する） 。
    [0027] 培養後、 培養液中の抗体価をチェ ックし、 目的とする 杭体を產生しているハイブリ ドーマのみを選択し単離す る （クローニング〉 。 培養液中の抗体価のチェ ックは、 ラジ τίィムノアツセィ法 （ R I A ) , 酵素抗体法 （ E L I S A , 螢光抗体法などの、 抗原への抗体の結合その ものを検出する方法と、 ウィルスの生物活性を阻害する 抗体の活性をみる方法等で行なうことができる。 クロー ニングによって選択された、 本発明の抗 CM V ♦ ヒ 卜 M
    [0028] C Aを産生するマウス一ヒ 卜ハイプリ ドーマは、 凍結し て保存することができる。 かかるハイプリ ドーマのセル ライン （細胞株） 及び/又はそれに由来する細胞株を適 当な方法で大量に培養すると、 培養上清から本発明の目 的とするヒ 卜 M GAを得ることができる。 また、 このハ イブリ ドーマを動物に移植して腫瘍化し、 その腹水や血 清からヒ 卜 M CAを得ることもできる。
    [0029] 以上の如-く して得られた抗 CM V ♦ ヒ 卜 M CAは、 次 のような特性を有する。 本発明で得られた抗 CMV ♦ ヒ 卜 M CAは、 多くの実験用 CM V株及び臨床分離株に共 通に反応する。 しかし、 他のヘルぺス群ウィルスである 単純へルぺスウィルス， E Bウィルス， 水痘帯状疱疹ゥ ィルスには反応しない。 また CM V感染細胞には反応す るが、 非感染細胞には反応しない。 従ってこれらの M C Aは CM Vに特異的であるといえる。 このように CM V に特異的であることが明瞭に示されたヒ 卜 M CAは、 本 発明において初めて得られたものである。
    [0030] CM Vは多くの抗原物質によって構成されている。 そ こで、 本発明のヒ 卜 M CAがどのような構成成分に対し て反応するのか検討した結果、 第 1群の M CAは分子量 約 64,000の蛋白 （糖蛋白を含む、 以下同じ〉 、 ないしは 約 64， 000を主成分とする複数の抗原蛋白に反応すること がわかった。 これらの M C Aは、 ウィルスを中和する能 力を有していない。 一 5、 第 2群の M CAは分子量約 130,000 の蛋白と分子量約 55, 000の蛋白に反応し、 この 群の M C Aの中には強いウイルス中和活性を有している M C Aがあることがわかった = これらの特性から考えて、 CM V感染の診断には、 第 Ί群と第 2群の M CAが使用 し得るが、 CM V感染の予防及び治療には第 2群の M C Aが適している。
    [0031] 本発明においては抗原物質を特に限定するものでなく、 C M V特異的ヒ 卜 M C Aはすべて本発明の範囲に含まれ る。 しかし、 予防及び治療という目的から考えたとき、 !VI CAにウィルス中和 （不活化） 活性があるという点は 極め て重要な特性である。
    [0032] 以下、 実施例により本発明を詳述する。
    [0033] 実施例 Ί
    [0034] (1) CM V抗原の作製
    [0035] 単層に増殖した H E L細胞に、 A D169 株感染細胞を 7 ： Ί の割合で混ぜ、 5日間 C02インキュベータ一中で 培養した。 こうして得られた感染細胞を、 0.1 % E D T Aを含むリ ン酸緩衝生理食塩水ではがし、 集めた。 次い で、 45秒間超音波破砕し、 3000rpm で 20分間遠心した上 清を得た。 これを 60 %と 20 %の重層ショ糖溶液の上に乗 せ、 10,000x g で Ί 時間遠心した。 60%層と 20%層の間 にウィルスは集まるので、 これを採取し、 再度超音波処 理によってよく分散させた。 これを 1,28g/c 3 の CsG 溶液の上にのせて、 100,000 X g で 42時間遠心した。 そ の結果、 密度勾配が形成された CsG 溶液の 1.29g/cm3 濃度のところに GM Vが集まったので、 これを採取し、 in vitro感作用抗原として用いた。
    [0036] また E L I SA用の抗原は次のように調製された - A D 169 を感染させた H E L細胞を G02インキュベータ一 中で培養し、 細胞変性がすべての細胞に観察されるよう になつ.た時点で、 感染細胞を集めた - この感染細胞を 3 分問超音波処理し、 3000rpm で 20分間遠心し'、 その上清 を得た。 これを E L I S A用抗原として用いた。
    [0037] (2) CM Vによるり ンパ球感作
    [0038] ヒ 卜の睥贜リ ンパ球を培養液 A ( R P I 1640+ 20% 眙 ¾牛血清 + 20mM H E P E S + 2 グルタミン + Ί
    [0039] a ビルビン酸十 0.02mg/ / /^セリン十 80 g ノ i ザン マイシン 〉 に浮遊させた π 細胞濃度は 12 Χ 105 個/ で あった。 この細胞浮遊液を Ί っ、 培養プレー 卜 （ 24 穴） の 15穴に入れた。 それらを 3穴ずつ 5群に分け、 第 Ί 群は無添加、 第 2群には CiVl V抗原 12ngタンパク Ζ 、 第 3群には B C (3 F 0.1 i , 第 5群には同量の C VI Vと B C G F、 第 5群には C VI Vと 20 g Z の P W Mを添 加した。 この培養プレー 卜を 37C, 5 % C02含有空気で 6日間培養した。 マウス ♦ ミエ口—マ細胞 P 3 X 63Ag 8 U Ί株 （ P 3 U Ί と略記する） との細胞融合
    [0040] 前もって P 3 U 1 を培養液 B ( R PM I 1640+ 10%胎 児牛血清 + 2mMグルタミン + 80jc g i ゲンタマイシン ） 中で培養しておいた。 使用時の細胞濃度は 6 X 105 個ノ であった。 上記（2) の感作リンパ球 （ 3穴を一緒にし た） 5群と P 3 U 1 を、 それぞれ別々に無血清 R PM I 1640で 2回洗浄した。 各群 3穴のリンパ球と 5 X 10^ 個 の P 3 U Ί とを試験管の中で一緒にした。 1500rpm で 5 分間遠心し、 上清を捨てた。 細胞ペレツ 卜を、 試験管を たたくことによって； よく分散させた - これに 0.5 の ポリエチレングリコ-—ル液 （ R P M 1 5.75 +ポ リエチレングリコール 1000 3.5 +ジメチルスルホキ サイ ド 0.75/^ ) ( P E G液と略記する） を加えて、 細胞 をゆるやかに浮遊させた - 1 分後に 0.5 R PiVI I 1640 を加え、 さらに 1 分後に 1 R P M I 、 さらに 2分後に 4 /^の 4.了'培養液 （ ^ 1 1640+ 20%胎児牛血清 + 80^g / i ゲンタマイ ンシン + IV1ヒポキサンチン + 0.4 ^ Mアミノプテリン + 1.6 . Mチミジン） 、 さらに 2分後には の HA T培養液を加えた。 最後に、 HA T培養液で 細胞浮遊液とした。 これを培養プレー 卜 ( 96穴〉 Ί枚に蒔いて、 37 . 5 % C02含有空気中で培 養した。 Ί 週間毎に半量の培養液を斩しい H T培養液 ( HA Tから Aを除去したもの） で交換していきハイブ リ ドーマを得た。
    [0041] (4) ヒ 卜 IgG と抗 CM V抗体の測定
    [0042] • E L I S Aによって測定した。 ヒ 卜 IgG を測定するた めにャギ抗ヒ 卜 IgG 抗体 mi ) を、 あるいは抗 5 CM V抗体を測定するために CM V ( A D 169 株〉 2 .U Q タンパク.//^を 50 ^ /'穴ずつそれぞれファルコン ♦ ミクロテス 卜 ΠΙの 96穴プレ一 卜に固定した c このプレ 一 卜にハイ アリ ドーマ培養上清 60 ^を加えて、 室温で Ί 時間放置した。 1 %牛血清アルブミン （ B S A ) を含
    [0043] 10 有するハンクス塩類緩衝液 （ H B S S— B〉 で 3回洗浄
    [0044] ' - の後、 ャギ抗ヒ'卜 igG 抗体一アル'力りフ ォ スファターゼ
    [0045] 000倍希釈液） を 60 ^加えて、 室温で 1 時間反応さ せた - さらに H B S S— Bで 3回洗浄したのち、 P—二 卜 口フ エニル ノ ォ スフ ェ ー トを 1 Mジエタ ノールァミン is + Ί iVl gO の ρΗ9,δ 溶液に 0.6mg /^の割合で溶 かした溶液 100 を如えた。 30分から 60分後に 405nm の吸光 ¾を測定し、 檫準 】G 液あるいは標準 CiM V陽性 血清との比較から、 その値を算出した。
    [0046] 全群とも％穴ァレー ト Ί 枚に細胞を蒔き、 96穴中の、
    [0047] 20 ハイプリ ドーマが成育してきた穴の数 （肉眼で判定〉 、 さらにそのうちヒ 卜 IgG を產生しているハイブリ ドーマ をもつ穴の数、 そして抗 C M V抗体を産生している穴の 数を第 Ί 表に示した。 C iVl Vと B C Θ卜を加えたときに 最も多くの抗〇 'VI V抗体產生ハイプリ ドーマが成育した in v i tro 全ハイプリ igG 抗 CMV
    [0048] ドーマ
    [0049] 感 作 (肉眼判定〉 産生
    [0050] 1 無添加 18 12 0
    [0051] 2 C IV！ V 20 27 1
    [0052] 3 B CG F 81 93 6
    [0053] 4 CM V + 84 96 32 B CG F
    [0054] 5 C !Vl V十 55 29 3 P WM 実施例 2
    [0055] ヒ 卜脾臓リ ンパ球を、 実施例 Ί の（2) の如く CM Vあ るいは で感作し、 実施例 Ί の（3) の如く P 3 U Ί と細胞融合を行なつた。 得られたハイプリ ドーマのうら CiM Vに対する M CAを産生しているハイプリ ドーマを 以 Fの如くクローニングした。
    [0056] (1) ハイァリ ドーマのクローニング
    [0057] クローニングは限定希釈法を用いた。 抗 CM V抗体陽 性の穴より細皑を取り出し、 細胞数を数え培養液 Bを用 い Ί個. /穴あるいは 10個 /穴で細胞を蒔いた。 2週間後 に細胞が十分増殖したので、 その上清に抗 CiVI V ♦ C Aがあるか否かを E L I SAによって測定し、 抗 CMV ♦ M CA産生ハイプリ ドーマを選別した。
    [0058] こうして、 ハイプリ ドーマ C 1 , C 3 , C 4 , C 7 , C 23反び G 41が樹立された。 これらのハイプリ ドーマは 安定に IgG 型の抗 CM V ♦ ヒ 卜 M C Aを産生し続けてい る。 ハイプリ ドーマ C41 は、 アメ リカン タイプ カル チ ヤ — コレクショ ン （ A T C C ) に 1986年 9月 2 9 日 に寄記され、 寄記番号は HB92I5である。
    [0059] (2) 抗 CM V ♦ ヒ 卜 M CAの調製
    [0060] 得られたハイプリ ドーマの 1つ CM1を無血清培地 I T ビ S ( R P I 1640 2容 +ダルべッコ—M E M Ί 容 + F 12 Ί 容十イ ンシュリ ン 8.5 g / + 卜ランスフェ リ ン 2 9 / +エタ ノールァミン 20 M +セレナイ 卜 2.5 X 10-3 M ) 中で培養した。 その培養上清を限外濾過 ( アミコン P30) で濃縮し、 0.02Mリ ン酸ナ トリウム ( p H 7. δ >に対して透析した - 同緩衝液で平衡化した D Ε カラム （フアルマシア社製〉 にかけ、 未吸着分画にヒ 卜 M CAを回収した :： ドデシル硫酸ナ 卜リゥ厶 ♦ ポリァ ク リ ノレアミ 卜'電気泳（sod i um dodecy I su I fate-poly- acrylainide gel electrophoresis, SOS-PAGE) で分析し た結果、 H鎖と L鎖からなる精製 M C A標品であること が確認された。
    [0061] 実施例 3
    [0062] (1) 抗 CM V ♦ ヒ 卜 M C Aの感染細胞に対する反応性 CM Vの A D169 株あるいは H i 株を感染させた H E L細胞及び感染させていない細胞に、 抗 CM V ♦ ヒ 卜 M CAである CM ， C 3 , C 4 , C 7 , C23-, C41を 反応させた。 さらにフル才レツセンイソチ才シァネィ 卜 (f luorescein i sothi ocyanate, FITC) 標識抗ヒ 卜 IgG 抗 体を反応させ、 螢光顕微鏡下で観察した。 その結果、 い ずれの M C.Aも非感染細胞には反応せず、 感染細胞のみ に反応した。 また C Ί , C 3 , C 4 , C 7は A D 169 あ るいは H i — 1感染細胞の細胞質内 GMV抗原に反応し て、 細胞膜上の CM V抗原には反応しなかった。 他方、 C 23と CM1は.細胞質内抗原と細胞膜上抗原の両方に反応 した。
    [0063] (2) 抗 CM V ♦ M C Aの可溶化ウィルス抗原に対する反 応性
    [0064] 抗 C M V ♦ M C Aのヘルぺス属ウィルスに対する結合 性を調べるため、 H S V— Ί型 2株， H S V— 2型 2株， V Z V 2株， CM V 6株， E B V Ί株を各々感染させた H E L細胞及び非感染 H E L細胞から、 実施例 Ί の（1) の如く可溶化抗原を調製し、 実施例 Ί の（4) の如く E L I S Aを実施した。 その結果を第 2表に示した。
    [0065] 抗 C !Vl V ♦ !M C A ( ， C 2 , C 3 , C 7， C 23, C 1 ) はすべて CM Vにのみ結合し、 他のへルぺス属ゥ ィルス， 宿主細胞には結合しなかった。 また C41を除く 抗 C iVl V ♦ iVl C Aは C ΙΜ V 6株すべてに結合した。 なお、 H 1は単純へルぺスウィルス （ HS V ) に対するヒ G Aである。
    [0066] 第 2 表
    [0067]
    [0068] i直は、 405nmの吸収を示 。
    [0069] 不 2 0.1未満 ある。
    [0070] 実施例 4
    [0071] 抗 C iVl V ♦ ヒ 卜 iVl C Aのウィルス中和活性
    [0072] ヒ 卜 M C A溶液 200 H , 200 C H 50 ^の新鮮モル モッ 卜血清を 5倍希釈した溶液 100 ^及び CM V ( A D 169 株） 737 pfu(plaque-forming units) を含む溶液 100 〃 ^を混合し、 37。Cで Ί 時間インキュべ一 卜した。 この混合液 100 ^を 6穴プレー 卜に培養した H E L細 胞にかけ、 37。Cで Ί 時間インキュべ一 卜したのち、 0.5 % ( W/ V .) ァガロース及び 5 % ( VZ V ) F C Sを含 む M E M培地を加えて、 G02インキュベーター内で 1 1 日間培養した。 この単層細胞を 10%ホルマリ ン水溶液で 固定し、 0.3 %メチレンプル一水溶液によって染色した のち、 CM V感染によるプラーク ( Pfu)を計測した c 中和活性は次のように表した。 .'
    [0073] ^MC を入れない) MC を入れた)
    [0074] 1«対象の pfii ときの fu X 10ひ（¾)
    [0075] MC を入れない対象の pfu ) 結果を第 Ί 図に示した。 C23は 0.75 g ノ f で、 は 0.18 α ζ で 50%中和を示した。 しかしながら
    [0076] G 3 , C 4， C 7は全く中和活性を示さなかった。 また Hi- 1株を用いたときも、 〇23は3.3 Q で 100 %中和， C41は 0.95 g/ で 100 %中和を示したのに対し、 G 3 は 17.7 g/' で 35%の中和しか示さなかった。
    [0077] また、 実施例 3— (2) に掲げた A D 169 株以外の CM V株 5株について中和活性を調べたところ、 C 23は 10 il^ / ^で 95%以上の中和を全株について示した。 一方 C 41は実施例 3— (2) の第 2表に示した E L I S Aのデ —タと同様に、 10 g ¾3では1^0.12 株と Y A N— 3株 については、 各々 20%, 64%のやや弱い中和活性を示し、 他の株については 80%以上の中和活性を示した。
    [0078] 実施例 5
    [0079] 抗 CM V ♦ ヒ 卜 M C Aの免疫沈降分析
    [0080] ヒ 卜 iVI C Aが反応するウィルス粒子の構成成分が、 何 であるか決めるために、 免疫沈降分析を行なった。 H E L細胞に CM V ( A D 169 株〉 を感染させて、 35S—メ チォニンでァイソ 卜 -プ標識を行なった。 標識した細胞 を、 0. OHV! 〖ris♦ ト 0.15IV1 aG2+-1 %デ才キ シコール酸-ナ 卜リウ厶 + Ί % Tritonx 100 + 0.1 %ドデ シル硫酸 卜リウ厶 （ S D S ) 十 ^フ エニルメチルス ル ノ ォ ニル ノル 7f ライ ド （ pH 7.4) (溶解液） によって 溶解した。 これに抗 CM V ♦ ヒ 卜 M CAを加えて、 抗原 ♦ 抗体複合物を形成させておき、 さらにプロテイン A— セ フ ァ — ス 4 Bによっ て複合体を吸着精製した。 これ を、 0. I2b ;Vl iris♦ H« + 1 %S D S + 3 % 2—メル 力ア トエタ ノ ール十 15%グリセリン （ PH 8.2) で 3分間 100 ^処理し、 その上清を S D S—ポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動にかけた。 泳動後ゲルを乾燥させ、 X線フ ィルムに一 70ででさら した。
    [0081] その結果を第 2図に示した。 C Ί は約 64, 000と約 50, 000に、 C 2は約 64, 000と約 46, 000に、 C 4と C 7は 約 64，000に、 023と〇41は約130,000 と約 55, 000の分子 量をもつウィルス抗原に反応することが判った。
    [0082] 実施例 6
    [0083] 抗 C V ♦ M Q Aのァイソタイプの同定
    [0084] ヒ 卜 ! VI C Aのアイソタイプの同定は以下の如く行なつ た。 H鎖の同定は、 ヒ 卜 IgG2, IgG3, に対す るゥサギ抗血清を用いた免疫拡散法 （ τίクタロニー法〉 を用い、 L鎖の同定は、 A D169 感染細胞を抗原プレー 卜とし、 2次抗体にア 力リフ ォ スファタ一ゼ標識した ャギ抗ヒ 卜 K鎖ないしは 鎖を用いた E L I SAを行な つ に つ
    [0085] 結果を第 3表に示した =
    [0086] ύ 表
    [0087] 産業上の利用可能性
    [0088] 本発明の抗 CM V ♦ ヒ 卜 M CAは、 CM V感染の診断 薬とし 、 また CM V感染症の予防及び治療薬として利 用でさる。
    权利要求:
    Claims

    1 . サイ 卜メガロウィルスに対するヒ 卜 ♦ モノクロ一ナ ル抗体。
    2. ヒ 卜 ♦ モノクローナル抗体が IgG 1型である請求の 範囲第 Ί 項記載のヒ 卜 ♦ モノクローナル抗体。
    求
    3. 分子量約 64,000サイ 卜メガロウィルス抗原蛋白， ま たは分子量約 64: 000の抗原蛋の白を主成分とする複数のサ ィ 卜メガロウィルス抗原蛋白を認識する請求の範囲第 Ί 項記載のヒ 卜 · モノクローナル抗体。
    4. 分子量約 130:000 と約 55， 000のけィ 卜メガロウィル ス抗原蛋白を認識する請求の範囲第 Ί 項記載のヒ 卜 ♦ モ ノクローナル抗体。 b , サイ 卜メガロウィルスを中和する能力を有する請求 の範囲第 4項記載のヒ 卜 ♦ 七 ノクローナル抗体。
    6. ァメ り カ ン タイ ア カルチャー コ レクショ ン ( A T C C ) に寄記番号 HB9215として寄記されているハ ィ 7リ 卜一マ C 41, 又はそれと同様な抗原蛋白を認識す るハイアり ド -マによって産生される請求の範囲第 4項 記載のヒ 卜 ♦ 七 ノクローナル抗体。
    7. in V roでマイ 卜一ジェンの存在下に、 サイ 卜メガ ロウィルス はサイ 卜メ ガロウィルス由来の蛋白若しく は糖蛋白で感作したヒ 卜 ♦ リ ンパ球と、 マウス ♦ ミエ口 一マ細胞とを細胞融合させ、 得られたハイプリ ドーマの 中からサイ 卜メガロウィルスに対するヒ 卜 ♦ モノクロ一 ナル抗体を產生するハイプリ ドーマを選別し、 次いで該 ハイプリ ドーマ及び. Z又はそれに由来する細胞株を培養 し、 その培養上清からヒ 卜 ♦ モノクローナル抗体を採取 することからなる、 サイ 卜メガロウィルスに対するヒ 卜 ♦ モノクロ一ナル抗体の製造法。
    8 . A T G Cに寄記番号 9215として寄記されているハ ィプリ ドーマ C 4 'し 又はそれと同様な抗原蛋白を認識す るハイプリ ドーマつ
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